El western blot
es una técnica que se usa para detectar y cuantificar proteínas mediante una
electroforesis en gel; la transferencia del gel a una membrana adsorbente y el
revelado de la membrana mediante anticuerpos. Tal como se lee en la
Wikipedia su nombre viene por alusión a otra
técnica, el Southern blot, que a su vez tomaba el nombre de su descubridor (E.
Southern).
La verdad es
que, después de
esta entrada completa y
detallada sobre la
técnica del western blot en Scykness, poco queda por decir, y sin embargo no me
resisto a aportar mi granito de arena. He hecho mis primeros western (los
de la carrera, si los hice, no cuentan :P), y supongo que un químico se enfrenta de distinta manera y se fija en cosas distintas a las de un biólogo o bioquímico. Que nadie se ofenda, y sentiros muy libres de corregir :)
Así que aunque
existen muchas maneras y tipos de hacer cada uno de los pasos de que consta la
técnica de western blot, me voy a centrar exclusivamente en los pasos que
seguimos para cuantificar la enzima alfa-galactosidasa o GLA (que se usa para
el tratamiento de la
enfermedad de Fabry). Es decir, solo queríamos cuantificar
una única proteína, por un método ya establecido y usado varias veces.
Pero vayamos
poco a poco… ¿A qué nos referimos con la palabra “gel”? En la mayoría de los
casos se trata de un polímero en forma de red que nos sirve para “cargar”
nuestras proteínas y separarlas. En este caso los geles usados eran de
acrilamida junto al agente reticulante, de manera que finalmente obtenemos una
“red” de poliacrilamida. Como queremos que toda la muestra empiece el recorrido
a la vez, podemos usar un gel que tenga dos partes diferenciadas: el stacking y
el running. En realidad solo se distinguen por la concentración en acrilamida.
En el stacking tenemos los pocillos en los que cargamos la muestra, y cuando
llega a la frontera con el running se paran hasta que apliquemos la corriente
eléctrica. Tal como explica Óscar en el comentario abajo: El stacking gel tiene menos concentración de acrilamida/bisacrilamida para dejas pasar fácilmente todas las proteínas. Cuando llegan al Separating o running gel, se apelotonan y comienzan a migrar mas despacio, pero entran casi todas a la vez. Tanto para que pasen el stacking como para el separating se requiere corriente. No llegan solas al running gel. Incluyo las correcciones de Óscar en color azul.
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| Lo que parecen almenas representan los pocillos del stacking. Separating gel equivaldría a lo que llamamos running |
Antes de cargar
la muestra, la mezclamos con el tampón de carga, que básicamente contiene SDS y
urea (desnaturalizan la proteína presente y la dejan lista y preparada para la
electroforesis en gel. En este caso se pone SDS, un detergente, porque se trata de un gel desnaturalizante. Se pone por tanto no solo en la muestra sino también en el propio gel. Pero existe otra forma de hacer los geles de forma nativa. No se añade sds y los marcadores son distintos porque no solo migran por tamaño sino por Punto isoeléctrico.) y el glicerol, que es un muy importante… Porque los
geles se colocan en vertical en una cubeta llena de líquido (el tampón de
electroforesis)… Los pocillos son muy pequeños y has de cargarlos en el
interior del tampón con una punta de micropipeta. El glicerol es una molécula
“pesada”El glicerol no es mas pesado, es mas denso y arrastra la muestra al fondo del pocillo. que hace que nuestra muestra no se escape del pocillo hacia arriba
sino que caiga dentro y siga su recorrido por el stacking.
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| Cargando la muestra en los pocillos. El color azul ayuda a ver cómo hemos cargado el pocillo El colorante azul nos ayuda a ver como hemos cargado el pocillo y por donde va la migración... pero no solo eso. Es un indicador de pH. Si se pone amarillo, nuestras proteínas migrarán en sentido contrario, es decir, se saldrán por arriba. En ese caso debemos neutralizar con hidróxido sódico o algo parecido el pH de la muestra hasta volverla de nuevo azul. |
Una vez tenemos
listos nuestros geles con la muestra dentro de la cubeta, conectamos los
electrodos y aplicamos una determinada corriente eléctrica durante el tiempo
necesario para separar las proteínas. ¡Un momento! ¿Cómo vemos que está pasando
lo que tiene que pasar? En cada gel no solo se carga la muestra, sino también
una recta patrón y lo que se llama el marcador molecular. El marcador contiene
muchas proteínas con una tinción visible, las proteínas del marcador al
separarse en el gel, nos permiten ver que todo está saliendo bien. Hasta que no
revelemos nuestra muestra con anticuerpos, no podremos ver dónde ha quedado
nuestra proteína en el gel.
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| Aquí puedes ver la colocación en la cubeta para hacer la electroforesis |
Pero antes de
revelar, necesitamos transferir nuestro gel a una membrana absorbente, que está
hecha ¡de nitrocelulosa! La nitrocelulosa, o nitrato de celulosa o celuloide
puede formar una base transparente que se emplea en las emulsiones de las
películas fotográficas. En el caso de un western blot interesa que las bandas
del gel (la mayoría invisibles todavía para nosotros) se transfieran a la
membrana. ¿Cómo? Introduciendo los geles y las membranas en un sistema
“sandwich” (una vez más, lo tienes explicado en más detalle en
Scykness) y otra vez en la cubeta con un buffer o
tampón de transferencia. Aplicando electricidad, conseguiremos transferir las
bandas del gel a la membrana: todo listo para empezar a trabajar con los
anticuerpos.
Los anticuerpos
son moléculas que reaccionan muy específicamente a su antígeno, en este caso,
hemos seleccionado un anticuerpo de conejo anti-GLA; es decir, que su antígeno
es la GLA, por lo que podemos esperar que se una selectivamente a la proteína
de nuestras muestras. Pero además vamos a ayudarlo: porque si la membrana de
nitrocelulosa es buena como para que se “peguen” las proteínas desde el gel,
también lo será para que reaccione con el anticuerpo primario y eso no nos interesa…Empezamos
con el paso de bloqueo, que consiste únicamente en introducir nuestra membrana
en leche, que tiene montones de proteínas que se unirán a la membrana,
inactivando todos los sitios a los que podría unirse el anticuerpo. Así nos
aseguramos de que el anticuerpo se una casi exclusivamente a la GLA.
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Pero seguimos
sin ver nuestras bandas… Necesitamos el anticuerpo secundario: un anticuerpo de
anti-conejo (para que se pegue al anticuerpo primario) y que además contiene la
enzima peroxidasa. Ahora solo falta añadir los reactivos para que se produzca
la reacción quimioluminiscente: el luminol y el peróxido de hidrógeno (o agua
oxigenada). La enzima peroxidasa en presencia de agua oxigenada cataliza la
oxidación del luminol. ¿Te suena? Efectivamente: es la
reacción preferida de CSI.
Finalmente, con
el programa Quantity One podemos sacar fotos de nuestra membrana de
nitrocelulosa revelada a base de anticuerpos, y hacer una densitometría de las
bandas de proteína. El programa integra el área de la banda, haciendo el
sumatorio de la intensidad de cada pixel.
Y así, amigos y
amigas, podemos saber cuánta GLA hemos encapsulado haciendo ciencia básica, que
con un poquito de suerte y un muchito de trabajo, queremos conseguir que llegue
a ser un tratamiento para la enfermedad de Fabry. ¿Por qué me he empeñado en
daros la brasa con el western blot? Porque me resultó muy intrigante encontrar
membranas de nada menos que celuloide seguidas por el luminol, que me trajo a
la memoria el
XXIV Carnaval de Química, y si no leed lo que en su momento
escribió
@cuantozombi:
La química, la música
y el cine.
La temática de los
artículos que participan en el carnaval es libre, pero es vuestra oportunidad
de demostrar la influencia de la química en el cine y en la música. No solo en
el contenido de películas, productos televisivos o álbumes musicales, sino
también en la tecnología usada. Como la semana me ha dejado corto de
imaginación, os pongo algunos ejemplos cercanos:·
Roskiencia, el mayor exponente de la cantera de la divulgación, nos habló
hace poco del luminol, la
herramienta favorita de la legión de CSIs que llena nuestras pantallas.·
Ununcuadio nos habló de la química del cine
y su volatilidad.·
Y no podía dejar fuera al organizador del primer carnaval, no es una
historia nueva, pero hace poco alguien la sacó del baúl de los recuerdos: ¿Por qué el Dr. Manhattan eligió a Bohr? Aunque ya se que Watchmen es un comic –y qué
comic–, también es película y no hay que ser muy estricto.
Por eso: la
próxima vez que hagas un western blot, sonríe y piensa en cine (en La invención
de Hugo o Malditos bastardos aparece el celuloide), o bien en tus series
favoritas de CSI o ya asociándolo a @cuantozombi en The Walking Dead xDD
Para saber más:
Sobre el
celuloide: lo más completo y divulgativo lo encontrarás en
ISQCH.
Sobre los
western blot: una vez más te enlazo la
estupenda entrada de Scykness. Por si quieres algo más técnico,
relacionado con la cuantificación de GLA, puedes consultar este artículo:
Corchero, J., Mendoza, R., Ferrer-Miralles, N., Montràs, A., Martínez, L.,
& Villaverde, A. (2012).
Enzymatic characterization of highly stable
human alpha-galactosidase A displayed on magnetic particles Biochemical
Engineering Journal, 67, 20-27 DOI: 10.1016/j.bej.2012.05.003
También he consultado las entradas
en inglés de la Wikipedia:
Western blot y
gel electrophoresis, de donde he sacado la mayoría de las imágenes para este post.
